{"id":7233,"date":"2012-08-15T17:51:17","date_gmt":"2012-08-15T15:51:17","guid":{"rendered":"http:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/?p=7233"},"modified":"2013-02-07T15:52:45","modified_gmt":"2013-02-07T13:52:45","slug":"technologies-sequencage-gnome-humain-4","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/2012\/technologies-sequencage-gnome-humain-4\/","title":{"rendered":"Les technologies de s\u00e9quen\u00e7age du g\u00e9nome humain – 4"},"content":{"rendered":"

Apr\u00e8s avoir couvert<\/a> la m\u00e9thode de Sanger, le s\u00e9quen\u00e7age par terminateur r\u00e9versible et le pyros\u00e9quen\u00e7age, poursuivons notre d\u00e9couverte des technologies de s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN d\u00e9marr\u00e9e ici<\/a>. Vous verrez que la vari\u00e9t\u00e9 des techniques mises en \u0153uvre est tr\u00e8s grande et que la cr\u00e9ativit\u00e9 dans ce domaine est assez fascinante.<\/p>\n

Ces technologies impliquent une polym\u00e9risation de l\u2019ADN sous une forme ou une autre pour identifier les bases ajout\u00e9es, ou bien pas de polym\u00e9risation du tout et une d\u00e9tection directe des bases de l\u2019ADN par proc\u00e9d\u00e9 opto\u00e9lectronique ou \u00e9lectronique. C\u00f4t\u00e9 captation de l\u2019information, tout y passe : des capteurs CCD compl\u00e9t\u00e9s ou pas de lasers, de la microscopie \u00e9lectronique, et de la mesure \u00e9lectronique de conductance ou de pH.<\/p>\n

Un grand nombre de ces technologies n\u2019en sont qu\u2019\u00e0 l\u2019\u00e9tat de prototype et ne sont donc pas encore commercialis\u00e9es. Les startups en question annoncent toutes une commercialisation entre fin 2012 et 2013. Et les d\u00e9lais dans ce domaine sont aussi si ce n\u2019est plus \u00e9lastiques que dans le logiciel car il faut maitriser simultan\u00e9ment des questions de chimie, de fluidique, d\u2019\u00e9lectronique et de calcul, sans compter les questions d\u2019industrialisation du mat\u00e9riel !<\/p>\n

S\u00e9quen\u00e7age par ligation <\/strong>(SOLID technology de Life Technologies)<\/p>\n

La technologie SOLID est issue de la soci\u00e9t\u00e9 Agencourt Personal Genomics et a \u00e9t\u00e9 acquise par Applied Biosystem en 2006, elle-m\u00eame fusionn\u00e9e ensuite avec Life Technologies. SOLID veut dire \u201dSequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection\u201d. Le processus d\u00e9marre un peu comme pour le pyros\u00e9quen\u00e7age mode 454 Roche, \u00e0 savoir qu\u2019une biblioth\u00e8que de brins d\u2019ADN est associ\u00e9e \u00e0 une microbille magn\u00e9tique qui fait ici 1 micron d\u2019\u00e9paisseur via un adaptateur (petit brin d\u2019ADN) et que chaque brin est multipli\u00e9 par emPCR. Le r\u00e9sultat est fix\u00e9 sur une plaque de verre et non dans des micro-cuves. Chaque brin est associ\u00e9 \u00e0 une amorce pour pouvoir initialiser sa r\u00e9plication.<\/p>\n

C\u2019est alors qu\u2019a lieu une s\u00e9rie d\u2019op\u00e9rations chimiques assez ing\u00e9nieuses pour r\u00e9pliquer ces brins d\u2019ADN et d\u00e9tecter au fur et \u00e0 mesure les bases qui sont ajout\u00e9es. Il s\u2019appuie sur la ligation, un processus habituellement utilis\u00e9 pour la r\u00e9paration (automatique) de l\u2019ADN des cellules, notamment lors de sa r\u00e9plication (naturelle). Une prot\u00e9ine complexe, la ligase, est capable de raccommoder des morceaux d\u2019ADN les uns aux autres.<\/p>\n

Le processus consiste \u00e0 ajouter par ligase et de mani\u00e8re r\u00e9p\u00e9titive, des blocs de 8 bases avec une paire de bases qui correspondront aux deux suivantes \u00e0 synth\u00e9tiser dans chaque brin d\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer (parmi 16 possibles, 4×4), pr\u00e9c\u00e9d\u00e9e de trois bases degenerate et suivie de trois bases universelles et d\u2019un marqueur au fluor qui seront \u00e9limin\u00e9es. Des bases degenerate et universelles ? Il s\u2019agit de bases qui sont capables de s\u2019apparier avec n\u2019importe laquelle des quatre bases de l\u2019ADN. Comme la deoxyinosine, une base G sans son amine (NH2).<\/p>\n

\"Ligation<\/a><\/p>\n

Les 16 paires de bases diff\u00e9rentes que l\u2019on va assembler \u00e0 l\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer sont marqu\u00e9es par fluorescence. Mais avec 16 couleurs diff\u00e9rentes ? Non, ce serait trop simple. On utilise seulement quatre couleurs diff\u00e9rentes car visiblement il est d\u00e9licat d\u2019en utiliser plus en biochimie. Ce qui veut dire que la d\u00e9tection de la couleur donne une information partielle sur la nature de la paire de bases d\u00e9tect\u00e9e. L\u2019astuce consiste \u00e0 ajouter donc pas \u00e0 pas des s\u00e9ries de paires de bases d\u00e9tect\u00e9es par fluorescence suivies de 3 bases universelles, d\u2019enlever le tout et de recommencer l\u2019op\u00e9ration quatre fois en la d\u00e9calant d\u2019une base, gr\u00e2ce \u00e0 des amorces de taille diff\u00e9rente (de 1 \u00e0 4 bases en moins que la premi\u00e8re). Cela permet par recoupement d\u2019identifier les bases de l\u2019ADN et qui plus est,\u00a0 de les mesurer chacune deux fois. Ce qui r\u00e9duit le niveau des erreurs de lecture \u00e0 1 pour 1000, soit dix fois mieux que dans le pyros\u00e9quen\u00e7age. C\u2019est l\u2019aspect le plus diff\u00e9rentiant de cette technologique.<\/p>\n

Tout ceci est un peu compliqu\u00e9 \u00e0 piger. Il faut en tout cas retenir que ce syst\u00e8me est capable de lire un milliard de bases par batch ce qui est un niveau tr\u00e8s concurrentiel \u00e0 ce jour.<\/p>\n

Et la machine ? La voici, et elle coute environ $500K. Petit d\u00e9tail, je n\u2019ai pas pu savoir dans la litt\u00e9rature correspondante comment fonctionnait le capteur d\u2019image de la plaque de verre utilis\u00e9e pour le s\u00e9quen\u00e7age ni quoi que ce soit sur sa taille. On va supposer qu\u2019il s\u2019agit d\u2019un capteur d\u2019image classique ou bien voisin de celui qui est exploit\u00e9 dans la machine GS FLX Titanium XL+ de Roche. Par contre, on sait que le bas de la machine comprend un PC sous Linux avec 13 Teraoctets de stockage pour enregistrer toutes les images g\u00e9n\u00e9r\u00e9es par la lecture du s\u00e9quen\u00e7age base par base et ensuite reconstruire l\u2019ADN par calcul. Les donn\u00e9es brutes \u201cimage\u201d d\u2019un s\u00e9quen\u00e7age de ce type prennent en effet beaucoup de place !<\/p>\n

\"ABI<\/a><\/p>\n

S\u00e9quen\u00e7age par semiconducteur <\/strong>(Ion Torrent \/ Life Technologies)<\/p>\n

La Proton de Ion Torrent est un s\u00e9quenceur qui ne s\u2019appuie pas sur la d\u00e9tection de fluorescence de nucl\u00e9otides ou de leurs r\u00e9sidus de polym\u00e9risation par un capteur optique CCD. Il utilise un capteur CMOS qui d\u00e9tecte non pas des photons mais des ions, plus pr\u00e9cis\u00e9ment les ions H+ qui sont d\u00e9gag\u00e9s lors de la polym\u00e9risation de l\u2019ADN. Un ion H+ est en fait un simple proton qui gambade sans \u00e9lectron !<\/p>\n

Ce capteur est associ\u00e9 \u00e0 des micro-puits comme pour le s\u00e9quen\u00e7age 454. Le capteur CMOS mesure le pH (l\u2019acidit\u00e9) dans chacune des cavit\u00e9s, ce qui indique la pr\u00e9sence d\u2019une ou de plusieurs bonnes bases qui ont \u00e9t\u00e9 int\u00e9gr\u00e9es dans l\u2019ADN en cours d\u2019analyse. Chaque cavit\u00e9 permet de s\u00e9quencer un brin d\u2019ADN d\u2019environ 200 bases. Le processus est sinon voisin du pyros\u00e9quen\u00e7age avec ajout des bases les unes apr\u00e8s les autres pour \u201cvoir\u201d laquelle \u201cprend\u201d dans chaque cavit\u00e9. Puis rin\u00e7age par microfluidique et passage \u00e0 la base suivante \u00e0 tester.<\/p>\n

\"ion-proton\"<\/a>\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 \"Ion<\/a><\/p>\n

La premi\u00e8re version exp\u00e9rimentale du chipset CMOS de Ion Torrent comprenait 25 \u00e9lectrodes de 300×500 microns sur une surface de 5,3 mm2. Sont arriv\u00e9s ensuite les chipsets 314, 316 et 318, le dernier comprenant 11 millions d\u2019unit\u00e9s de d\u00e9tection. Il sont int\u00e9gr\u00e9s dans le s\u00e9quenceur Ion PGM Sequencer. Le chipset 318 fait 17,5mm2 de c\u00f4t\u00e9 avec des unit\u00e9s de d\u00e9tection de 5,1 microns de c\u00f4t\u00e9. Ce qui donne 11,7 millions d\u2019unit\u00e9s de d\u00e9tection. Elles sont produites sur des wafers de 8 pouces comportant 200 chipsets. Les chipsets sont combin\u00e9s dans les machines \u00e0 de la microfluidique pour l\u2019alimentation en ADN et en agents de s\u00e9quen\u00e7age.<\/p>\n

Ce niveau d\u2019int\u00e9gration est donc de deux ordres de grandeur plus grands qu\u2019avec les machines de pyros\u00e9quen\u00e7age 454 de Roche. On passe en effet de 54 microns \u00e0 5,1 microns pour la largeur des unit\u00e9s de d\u00e9tection de polym\u00e9risation d\u2019ADN. L\u2019int\u00e9gration est donc de (54\/5,1)^2 plus grande, soit exactement 112 fois. Mais Ion annonce \u00eatre capable \u00e0 assez court terme de fabriquer des capteur CMOS avec un milliard d\u2019unit\u00e9s de d\u00e9tection. Par contre, les brins d\u2019ADN s\u00e9quen\u00e7ables sont un peu plus courts et font un maximum de 200 bases. Les batches de s\u00e9quen\u00e7age durent 2 \u00e0 4 heures.<\/p>\n

\"IonTorrent<\/a><\/p>\n

Mais ce n\u2019est pas tout. Les s\u00e9quenceurs Ion Proton sont dot\u00e9s d\u2019une nouvelle g\u00e9n\u00e9ration de chipsets, le Proton I et le Proton II qui comprennent respectivement 165 et 660 millions d\u2019unit\u00e9s de d\u00e9tection. En un seul batch de deux heures, ce dernier peut s\u00e9quencer des brins d\u2019ADN de 100 bases en moyenne. Ce qui donne 66 Giga bases. Comme le g\u00e9nome humain en comporte 3, cela donne un taux de couverture de plus de 30x, ce qui est excellent mais qui sous-entend un taux d\u2019erreurs significatif. Il est notamment li\u00e9 au nombre relativement restreint de bases que les brins analys\u00e9s peuvent comporter (100 \u00e0 200). Plus il est faible, plus il est difficile de reconstituer le puzzle de l\u2019ADN par traitement num\u00e9rique.<\/p>\n

La soci\u00e9t\u00e9 Ion Torrent avait \u00e9t\u00e9\u00a0 fond\u00e9e en 2007 par Jonathan Rothberg, l\u2019un des cr\u00e9ateurs de 454 Life Science Corp qui l\u2019avait revendu \u00e0 Roche pour $140m. Ion Torrent a \u00e9t\u00e9 acquise par la soci\u00e9t\u00e9 californienne Life Technologies pour $725m en 2010. La m\u00eame qui commercialise la technologie SOLID, apr\u00e8s une fusion avec Applied Biosystems op\u00e9r\u00e9e en 2008. Ce groupe fait un CA annuel d\u2019environ $4B (4 milliards de dollars) et emploie plus de 10000 personnes. On est loin de la startup !<\/p>\n

SMRT <\/strong>(Single Molecule Real-Time Analysis de Pacific Bioscience, $250m lev\u00e9s)<\/p>\n

Cette technologie utilise le marquage par fluorescence couleur des nucl\u00e9otides ajout\u00e9es aux brins d\u2019ADN transcrits par polym\u00e9rase. Leur ajout est d\u00e9tect\u00e9 en v\u00e9ritable temps r\u00e9el au fur et \u00e0 mesure de leur ajout au brin d\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer.<\/p>\n

Son b\u00e9n\u00e9fice principal est de permettre de lire d\u2019une traite des s\u00e9quences allant jusqu\u2019\u00e0 3000 bases, pour 100 \u00e0 1000 pour les technologies que nous avons vues jusqu\u2019\u00e0 pr\u00e9sent. Cela contribue \u00e0 diminuer le nombre d\u2019erreurs et \u00e0 r\u00e9duire le niveau de taux de couverture (# de bases \u00e0 d\u00e9tecter par redondance \/ nombre de bases de l\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer). Un batch dure moins d\u2019une journ\u00e9e.<\/p>\n

\"PCB-090310-30456-LoadingScreen_hi<\/a><\/p>\n

La \u201cPacBio RS\u201d (machine ci-dessus<\/em>) utilise des chipsets nanofluidiques qui contiennent des petits trous de quelques dizaines de nanom\u00e8tres d\u2019\u00e9paisseur au fond desquels est attach\u00e9 une mol\u00e9cule d\u2019ADN polym\u00e9rase qui sert \u00e0 g\u00e9rer une transcription contr\u00f4l\u00e9e de brin d\u2019ADN. C\u2019est l\u2019ADN qui va se d\u00e9placer base par base sur cette ADN polym\u00e9rase et non le contraire.<\/p>\n

\"Pacific<\/a><\/p>\n

Des nucl\u00e9otides marqu\u00e9s par fluorescence sont int\u00e9gr\u00e9s dans l\u2019ADN en cours de transcription. Les cavit\u00e9s du chipset appel\u00e9es \u201czero mode waveguides\u201d vont capter les quelques photons \u00e9mis par la fluorescence de la nucl\u00e9otide int\u00e9gr\u00e9e dans l\u2019ADN, qui est activ\u00e9e par rayon laser, et la router via des fibres optiques vers un capteur CCD (sch\u00e9ma ci-dessous<\/em>).<\/p>\n

\"SMRT<\/a><\/p>\n

Les chipsets SMRT contiendraient actuellement 150000 cavit\u00e9s. C\u2019est peu au regard des autres syst\u00e8mes de s\u00e9quen\u00e7age massivement parall\u00e8les. Mais celui-ci fonctionne r\u00e9ellement en temps r\u00e9el : il ne faut pas attendre 2 minutes entre chaque ajout de base pour faire le m\u00e9nage avec des solvants. Ici, les bases sont incorpor\u00e9es les unes apr\u00e8s les autres. Entre chaque incorporation s\u2019\u00e9coulent seulement quelques millisecondes.<\/p>\n

S\u00e9quen\u00e7age \u00e0 l\u2019aide de nanopores <\/strong>(GeniaChip, BioNano Genomics, NABsys, NobleGen, Oxford Nanopore Technologies, Stratos Genomics)<\/p>\n

Cette technologie est encore plus \u00e9bouriffante que les pr\u00e9c\u00e9dentes. Elle consiste \u00e0 faire passer des brins simples ou doubles d\u2019ADN au travers de trous, des nano-pores, et \u00e0 lire les bases qui les traversent une par une, ou bien des sondes ou marqueurs associ\u00e9s. Nuance cependant : les s\u00e9quenceurs utilisant ces technologies ne semblent pas encore au point et rel\u00e8vent encore de l\u2019effet d\u2019annonce. Les nanopores sont r\u00e9alis\u00e9s soit \u00e0 base de prot\u00e9ines soit sur circuit int\u00e9gr\u00e9 \u00e0 base de silicium. Soit les deux.<\/p>\n

Ce genre de technologie est notamment propos\u00e9 par GeniaChip<\/strong> (Mountain View, cr\u00e9\u00e9e en 2009) qui exploite des brins simples d\u2019ADN (ssDNA ou single stranded DNA). Lorsque ces brins traversent des pores de 2 nanom\u00e8tres de diam\u00e8tre qui sont en fait des sites mol\u00e9culaires actifs (ci-dessous<\/em>), ils modifient le courant \u00e9lectrique qui les traverse, et cela tombe bien, ce courant d\u00e9pend de la base d\u2019ADN. Les nano-pores sont faites de prot\u00e9ines lipidiques install\u00e9es sur un substrat silicium. La technologie pr\u00e9sente plein d\u2019avantages : on n\u2019a pas besoin d\u2019ajouter tout un tas de composants chimiques pour entretenir la r\u00e9action, elle est tr\u00e8s rapide et il n\u2019y a pas d\u2019amplification d\u2019ADN g\u00e9n\u00e9ratrice d\u2019erreurs. Elle pourrait permettre \u00e0 terme de s\u00e9quencer le g\u00e9nome humain en moins d\u2019un quart d\u2019heure\u2026 hors traitements informatiques qui pourraient alors repr\u00e9senter le gros du temps du s\u00e9quen\u00e7age.<\/p>\n

Avec celle de Ion Torrent, c\u2019est la seconde technologique de s\u00e9quen\u00e7age \u201cnon optique\u201d examin\u00e9e dans ces lignes. Le processus est tr\u00e8s rapide puisqu\u2019une base peut \u00eatre lue toutes les 10 nanosecondes ! Comme la mesure est \u00e9lectrique, l\u2019\u00e9lectronique peut suivre, ce qui ne sera pas le cas avec une mesure optique et un capteur CMOS ou CCD. Seul probl\u00e8me de taille \u00e0 r\u00e9gler : la mesure est entach\u00e9e de nombreuses erreurs qu\u2019il faut ensuite corriger. Sans compter la m\u00e9canique, en g\u00e9n\u00e9ral \u00e9lectrique, pour faire passer le brin d\u2019ADN au travers des nano-chats d\u2019aiguille ! C\u2019est pourquoi d\u2019autres soci\u00e9t\u00e9s cherchent \u00e0 soit ralentir le processus soit \u00e0 augmenter la taille des \u00e9l\u00e9ments mesur\u00e9s au travers des nanopores.<\/p>\n

\"NIHMS285056.html\"<\/a>\"GeniaChip<\/a><\/p>\n

Chez NABsys <\/strong>(Providence, Rhode Island, $21m lev\u00e9s), on utilise ainsi une technique de \u201cpositional sequencing\u201d qui hybride de longs fragments d\u2019ADN simples de plus de 100K bases \u00e0 diff\u00e9rentes positions avec une sonde qui combine six bases d\u2019ADN et une mol\u00e9cule complexe pour sa d\u00e9tection. L\u2019ensemble est compl\u00e9t\u00e9 avec le reste de l\u2019autre brin et des prot\u00e9ines d\u2019assemblage. Il passe ensuite au travers d\u2019un nanopore qui d\u00e9termine la position des sondes par conductivit\u00e9 \u00e9lectrique et au rythme de un million de bases par seconde. Ces positions sont entach\u00e9es d\u2019erreurs qui sont corrig\u00e9es ensuite par calcul et en utilisant la redondance du syst\u00e8me.<\/p>\n

Il faut r\u00e9aliser plusieurs fois cette op\u00e9ration sur le m\u00eame brin d\u2019ADN et avec des sondes diff\u00e9rentes de 6 bases permettant de bien couvrir l\u2019ADN. Il en faudrait 4096 en th\u00e9orie pour couvrir toutes les combinaisons de 6 bases d\u2019affil\u00e9e (4 puissance 6). Les capteurs qui comportent des dizaines de milliers de nanopores par cm2 sont con\u00e7us avec des technologies de fabrication de semi-conducteurs traditionnelles et en mode \u201cfabless\u201d (sans usine) comme il se doit. Les chipsets peuvent m\u00eame fonctionner en parall\u00e8le, pour cr\u00e9er des syst\u00e8mes de s\u00e9quen\u00e7age de masse extr\u00eamement rapides. La technologie est actuellement au stade de l\u2019industrialisation. Traduction : pas encore commercialis\u00e9e.<\/p>\n

\"Nabsys<\/a><\/p>\n

Il y a aussi l\u2019am\u00e9ricain PathoGenetix <\/strong>qui propose une technique de s\u00e9quen\u00e7age qui rappelle celle de Nabsys mais utilise des tags de 3 bases en lieu et place de 6 bases, qui sont d\u00e9tect\u00e9s ensuite par passage des brins d\u2018ADN greff\u00e9s dans un syst\u00e8me de microfluidique. Cela permet de faire passer 150 millions de bases par secondes. Le syst\u00e8me qui a \u00e9t\u00e9 financ\u00e9 \u00e0 hauteur de $50 par le DHS (Department of Homeland Security), un record de financement public dans le secteur, semble viser non pas le s\u00e9quen\u00e7age complet de g\u00e9nome mais la d\u00e9tection de variations pour l\u2019identification de personnes.<\/p>\n

NobleGen BioSciences <\/strong>est une startup am\u00e9ricaine cr\u00e9\u00e9e par un chercheur et ayant re\u00e7u $12,5m de financements publics via la NSF et diff\u00e9rents concours.Elle utilise aussi des nanopores mais avec encore un autre proc\u00e9d\u00e9. L\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer est d\u2019abord transform\u00e9 en une mol\u00e9cule synth\u00e9tique o\u00f9 chaque base d\u2019origine est convertie en une s\u00e9quence de nucl\u00e9otides unique qui est appari\u00e9e \u00e0 une mol\u00e9cule compl\u00e9mentaire dot\u00e9e d\u2019un fluorophore de couleur unique et d\u2019un compl\u00e9ment (beacon). C\u2019est une sorte d\u2019inverse de la compression en num\u00e9rique qui est ici utile pour am\u00e9liorer la pr\u00e9cision de la mesure. Cela donne une mol\u00e9cule \u00e0 double-brin ressemblant \u00e0 l\u2019ADN qui est pouss\u00e9e dans le nanopore. Parce que les nanopores sont trop \u00e9troits, les marqueurs fluorescents sont \u00e9limin\u00e9s, ce qui g\u00e9n\u00e8re une lumi\u00e8re qui est capt\u00e9e optiquement et via une excitation par un laser. Le processus permet en pratique de d\u00e9coder 96 g\u00e9nomes diff\u00e9rents en 17 heures.<\/p>\n

\"NobleGen<\/a><\/p>\n

Stratos Genomics<\/strong> (Seattle, $7m lev\u00e9s) utilise une technologie diff\u00e9rente mais avec la m\u00eame finalit\u00e9 : r\u00e9duire les erreurs de lecture au travers des nanopores en rallongeant\u00a0 artificiellement la taille des bouts d\u2019ADN \u00e0 analyser. Ici, d\u2019un facteur 50 bien plus grand qu\u2019avec la technologie de NobleGen. Elle intercale toutes les quatre bases d\u2019un brin d\u2019ADN double branche une mol\u00e9cule appel\u00e9e \u2018xpandomer\u2019 via un processus voisin de la r\u00e9plication qui utilise une polym\u00e9rase sp\u00e9cifique. L\u2019autre brin de l\u2019ADN est enlev\u00e9 par d\u00e9naturation, plus pr\u00e9cis\u00e9ment, par chauffage. Les \u2018expandomer\u2019 s\u2019\u00e9tendent comme leur nom l\u2019indique pour rallonger l\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer. Tout ceci est expliqu\u00e9 dans un brevet<\/a> si vous avez le courage de vous le farcir. Ca a l\u2019air bien astucieux mais aucune caract\u00e9ristique pr\u00e9cise du syst\u00e8me n\u2019est pour l\u2019instant indiqu\u00e9e par le concepteur au-del\u00e0 de dire qu\u2019il peut s\u00e9quencer 10 millions de bases par seconde. Le syst\u00e8me n\u2019est bien \u00e9videmment pas plus disponible que les autres dans cette cat\u00e9gorie \u201cnanopores\u201d.<\/p>\n

\"Stratos<\/a><\/p>\n

Oxford Nanopore Technologies <\/strong>(Oxford UK et USA, $120m lev\u00e9s, avec investissement d\u2019Illumina, cr\u00e9ation en 2005, plus de 300 brevets d\u00e9pos\u00e9s) et son syst\u00e8me GridION permet de s\u00e9quencer des mol\u00e9cules d\u2019ADN \u00e0 simple brin selon deux m\u00e9thodes diff\u00e9rentes. Dans les deux cas, les nanopores utilis\u00e9s sont \u00e0 base de prot\u00e9ines complexes d\u00e9pos\u00e9es\u00a0 sur une membrane synth\u00e9tique en polym\u00e8re. Le tout est pos\u00e9 sur un chipset produit en ASIC<\/a> (circuit int\u00e9gr\u00e9 con\u00e7u pour une seule application). L\u2019ensemble est dans une cartouche de consommable.<\/p>\n

Dans la premi\u00e8re m\u00e9thode, un ADN double-branche est accroch\u00e9 \u00e0 une enzyme qui va s\u2019amarrer au nanopore et d\u00e9clencher le passage de l\u2019un des brins de l\u2019ADN dans celui-ci puis le second brin. Les bases qui traversent le nanopore sont d\u00e9tect\u00e9es \u00e9lectriquement comme avec le GeniaChip, mais semble-t-il, par blocs de 4 ce qui r\u00e9duit les erreurs. Quand le premier brin a \u00e9t\u00e9 analys\u00e9, l\u2019autre brin l\u2019est \u00e9galement (animation<\/a>), et dans l\u2019autre sens, ce qui cr\u00e9\u00e9 une information redondante limitant les erreurs de s\u00e9quen\u00e7age. Dans une seconde m\u00e9thode, une exonucl\u00e9ase (enzyme qui coupe l\u2019ADN un nucl\u00e9otide \u00e0 la fois) est attach\u00e9e \u00e0 la fois \u00e0 l\u2019ADN et au nanopore. Elle d\u00e9plume l\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer base par base. Chaque base enlev\u00e9e passe au travers d\u2019une cyclodextrine, une mol\u00e9cule int\u00e9gr\u00e9e dans le nanopore, et est d\u00e9tect\u00e9e \u00e9lectriquement. Comme elles sont bien s\u00e9par\u00e9es les unes des autres, les risques d\u2019erreurs sont limit\u00e9s.<\/p>\n

\"Oxford<\/a><\/p>\n

La machine serait commercialis\u00e9e \u00e0 $30K. au format 2U, elle est con\u00e7ue pour fonctionner de mani\u00e8re parall\u00e8le avec plusieurs unit\u00e9s contr\u00f4l\u00e9es de mani\u00e8re unique dans des racks, comme dans un datacenter. Les donn\u00e9es pouvant \u00eatre upload\u00e9es \u00e0 distance et contr\u00f4l\u00e9es dans une application fonctionnant dans un navigateur. Comme les r\u00e9sultats sont r\u00e9cup\u00e9r\u00e9s en temps r\u00e9el, on peut arr\u00eater le s\u00e9quen\u00e7age lorsque l\u2019on a obtenu assez de donn\u00e9es, ce qui fait gagner du temps. Ce genre d\u2019outil est clairement destin\u00e9 \u00e0 une exploitation industrielle \u00e0 grande \u00e9chelle et pas que pour faire de la recherche. A l\u2019autre extr\u00e9mit\u00e9, la soci\u00e9t\u00e9 pr\u00e9voit de sortir un mini-s\u00e9quenceur qui tiendra dans une simple cl\u00e9 USB et qui sera commercialis\u00e9 \u00e0 $900. Impressionnant ! Cette soci\u00e9t\u00e9 a obtenu l\u2019un des plus gros financements en capital risque de toutes celles que je suis en train de couvrir ici. La technologie devrait \u00eatre disponible d\u2019ici d\u00e9but 2013.<\/p>\n

\"Oxford<\/a><\/p>\n

Enfin, chez BioNano Genomics <\/strong>(Philadelphie, $33m lev\u00e9s, cr\u00e9\u00e9 en 2003), on a invent\u00e9 un syst\u00e8me de micro-canaux permet de d\u00e9bobiner progressivement un brin d\u2019ADN et de le faire passer dans un nanotube en longueur. Le brin est marqu\u00e9 de diverses mani\u00e8res par fluorescence et un d\u00e9tecteur optique permet d\u2019identifier les diff\u00e9rentes parties de ce brin. Avec cette technologie, les brins d\u2019ADN peuvent comporter jusqu\u2019\u00e0 un million de paires de bases. Un syst\u00e8me \u00e9lectrique fait avancer l\u2019ADN pas \u00e0 pas dans les nano-tubes et un capteur CCD (le nanoAnalyzerCCD) d\u00e9tecte les marqueurs qui passent. Ces marqueurs permettent d\u2019identifier des g\u00e8nes ou des modifications de zones connues. Mais pas les s\u00e9quences de bases \u00e0 proprement parler. Les marqueurs permettent de visualiser la structure d\u2019ensemble de l\u2019ADN pour en faire une sorte de cartographie. Un g\u00e9nome humain va pouvoir \u00eatre d\u00e9coup\u00e9 (avec des enzymes de restriction bien choisies) en quelques milliers de brins d\u2019un million de paires de bases qui vont \u00eatre analys\u00e9s en parall\u00e8les en moins de 10 minutes. Ce qui semble tr\u00e8s prometteur. La technologie est cependant prometteuse : elle pourrait \u00eatre coupl\u00e9e \u00e0 un syst\u00e8me de d\u00e9tection de bases et pourquoi pas \u00e0 celui de GeniaChip. D\u2019o\u00f9 des travaux r\u00e9alis\u00e9s avec une autre soci\u00e9t\u00e9, Complete Genomics<\/strong>, pour r\u00e9aliser le s\u00e9quen\u00e7age des brins qui ont \u00e9t\u00e9 align\u00e9s dans le composant.<\/p>\n

\"BioNano<\/a>\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 \"BioNano<\/a><\/p>\n

On pourrait aussi citer IBM dont les laboratoires de recherche planchent sur la question de l\u2019optimisation du s\u00e9quen\u00e7age par nanopores avec ses DNA transistors<\/a> (ci-dessous<\/em>). Leur technique s\u2019appuie sur des nanopores en semi-conducteurs qui utilisent des couches altern\u00e9es de m\u00e9tal et de di\u00e9lectrique (isolant) permettant par le courant \u00e9lectrique qui traverse les premiers de contr\u00f4ler l\u2019avancement de l\u2019ADN dans le nanopore, et ensuite, de mesure la pr\u00e9sence des quatre bases. Le projet avait \u00e9t\u00e9 pr\u00e9sent\u00e9 en 2009 et depuis, plus de nouvelles ! Et on ne l\u2019a pas vu r\u00e9apparaitre sous la forme de technologie employ\u00e9e sous licence chez d\u2019autres fabricants. Cela veut dire que cela ne fonctionne peut-\u00eatre pas de mani\u00e8re satisfaisante !<\/p>\n

\"IBM<\/a><\/p>\n

Voil\u00e0 pour les nanopores. Difficile de d\u00e9partager toutes ces technologies. Certaines produisent moins d\u2019erreurs que les autres en lecture, mais celles qui en cr\u00e9ent le plus ont toutes des dispositifs de redondance et de calcul pour les r\u00e9duire \u00e0 la portion congrue dans les r\u00e9sultats finis.<\/p>\n

Analyse par microscopie \u00e9lectronique <\/strong>(Electron Optica, Reveo et ZS Genetics)<\/p>\n

Voici un autre groupe de technologies qui consiste \u00e0 utiliser un microscope \u00e9lectronique pour d\u00e9tecter les bases d\u2019ADN. Pourquoi pas si l\u2019engin n\u2019est pas trop lourd ! Il y a un hic dans l\u2019histoire : aucune des soci\u00e9t\u00e9s de ce cr\u00e9neau n\u2019arrive \u00e0 mettre au point sa technologie, \u00e0 lever suffisamment de fonds et \u00e0 \u00eatre comp\u00e9titive par rapport aux autres technologies de seconde et troisi\u00e8me g\u00e9n\u00e9ration.<\/p>\n

Quelques soci\u00e9t\u00e9s identifi\u00e9es dans ce secteur : Electron Optica <\/strong>dont le mat\u00e9riel est fabriqu\u00e9 par la soci\u00e9t\u00e9 tch\u00e8que Delong Instruments, Reveo <\/strong>et son Omni Molecular Recognizer Application (OmniMoRA) qui utilise des sondes d\u2019excitation des bases pour les rendre visibles au microscope \u00e9lectronique, et ZS genetics<\/strong> qui incorpore des labels \u2018ZSG\u2019 rendant les bases d\u00e9tectables au microscope \u00e9lectronique. Dans ces trois cas, il existe tr\u00e8s peu de litt\u00e9rature ou de description du mat\u00e9riel de s\u00e9quen\u00e7age.<\/p>\n

On pourrait par extension citer \u00e9galement Lightspeed Genomics <\/strong>(anciennement Solametrix, Santa Clara, Californie) qui utilise un capteur optique particulier d\u00e9nomm\u00e9 \u201cSynthetic Aperture Optics\u201d qui permet d\u2019am\u00e9liorer la r\u00e9solution d\u2019analyse de s\u00e9quen\u00e7age par fluorescence. Le processus consiste \u00e0 \u00e9clairer la zone \u00e0 capter avec des formes lumineuses diff\u00e9rentes et \u00e0 reconstituer avec ces images successives prises avec un capteur donn\u00e9 une image de r\u00e9solution sup\u00e9rieure. C\u2019est bien un fournisseur de technologie et pas une soci\u00e9t\u00e9 \u00e0 m\u00eame de fournir un syst\u00e8me de s\u00e9quen\u00e7age cl\u00e9 en main qui n\u2019est qu\u2019une des applications de son syst\u00e8me.<\/p>\n

\"LightSpeed<\/a><\/p>\n

Il faut signaler ici que cette s\u00e9rie d\u2019articles n\u2019examine pas toute une cat\u00e9gorie de machines de tests d\u2019ADN tr\u00e8s largement diffus\u00e9e dans les laboratoires. Celles-ci servent non pas \u00e0 s\u00e9quencer les g\u00e9nomes mais \u00e0 identifier des parties d\u2019ADN d\u00e9j\u00e0 connues et avec des marqueurs. Par exemple, des g\u00e8nes ou des g\u00e8nes modifi\u00e9s. C\u2019est dans ce domaine que l\u2019on trouve les \u201cDNA Arrays\u201d et \u201cDNA microarrays\u201d (puces \u00e0 ADN) qui permettent de tester un ADN dans des matrices de tests o\u00f9 chaque test va correspondre \u00e0 un marqueur donn\u00e9e, le plus souvent \u00e0 un g\u00e8ne. On va aussi \u00e9valuer l\u2019expression des g\u00e8nes, \u00e0 savoir identifier les g\u00e8nes op\u00e9rants d\u2019un organisme vivant. On le fait au travers de tests sur les ARN messagers d\u2019un \u00e9chantillon pour voir quels sont les g\u00e8nes de l\u2019ADN qui sont transpos\u00e9s en ARNm, qui produisent ensuite les prot\u00e9ines \u00e0 l\u2019aide des ribosomes. Autre application : d\u00e9tecter les \u201cpolymorphismes\u201d g\u00e9n\u00e9riques, \u00e0 savoir les variations des g\u00e8nes par rapport \u00e0 une r\u00e9f\u00e9rence d\u2019esp\u00e8ce. Cela sert aussi bien dans la sant\u00e9 que dans la police scientifique.<\/p>\n

Mais nombre de ces machines exploitent des processus biochimiques et des capteurs voisins de ceux que l\u2019on trouve dans les machines de s\u00e9quen\u00e7age. Ces machines sont plus sp\u00e9cialis\u00e9es. Leur traitement est en g\u00e9n\u00e9ral plus rapide que celui du s\u00e9quen\u00e7age et aussi moins couteux. Il y a aussi beaucoup moins de calculs num\u00e9riques dans le processus car il y a moins de donn\u00e9es \u00e0 r\u00e9cup\u00e9rer et on ne cherche g\u00e9n\u00e9ralement pas \u00e0 reconstituer le puzzle des suites de bases de l\u2019ADN r\u00e9colt\u00e9es en petits morceaux.<\/p>\n

Cependant, le march\u00e9 pourrait \u00e9voluer pour certaines applications en direction des machines de s\u00e9quen\u00e7age. Aujourd\u2019hui, s\u00e9quencer tout un g\u00e9nome ne sert \u00e0 rien si l\u2019on cherche \u00e0 identifier juste quelques g\u00e8nes correspondant \u00e0 une pathologie donn\u00e9e. Mais comme le cout du s\u00e9quen\u00e7age baisse inexorablement, on risque de voir de plus en plus d\u2019applications se reposer sur celui-ci. Qui peut le plus peut le moins\u2026 Mais les tests de biog\u00e9n\u00e9tique ne concernent pas que l\u2019ADN lui-m\u00eame on l\u2019a vu, donc le s\u00e9quen\u00e7age ne sera pas la r\u00e9ponse \u00e0 toutes les questions.<\/p>\n

C\u2019en est termin\u00e9 pour cette partie sur les technologies biologiques et mat\u00e9rielles de s\u00e9quen\u00e7age. Il faudrait pouvoir benchmarker ces machines \u2026 mais comment ? Qui fait cela ? Pas trouv\u00e9.. mais cela va bien arriver un jour.<\/p>\n

Etape suivante\u2026 nous allons revenir au bon vieux num\u00e9rique et couvrir le traitement des donn\u00e9es de s\u00e9quen\u00e7age<\/a> qui sont plus qu\u2019abondantes. Avec notamment du big data au programme, mais pas seulement !<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Apr\u00e8s avoir couvert la m\u00e9thode de Sanger, le s\u00e9quen\u00e7age par terminateur r\u00e9versible et le pyros\u00e9quen\u00e7age, poursuivons notre d\u00e9couverte des technologies de s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN d\u00e9marr\u00e9e ici. Vous verrez que la vari\u00e9t\u00e9 des techniques mises en \u0153uvre est tr\u00e8s grande et que la cr\u00e9ativit\u00e9 dans ce domaine est assez fascinante. Ces technologies impliquent une polym\u00e9risation de […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[11,33,1570,37,10],"tags":[1611,1616,1610,1619,106,1608,1607,1604,1612,1605,1620,1613,1614,1609,1617,1565,1606,1615,1603,1618],"class_list":["post-7233","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-france","category-innovation","category-sante","category-siliconvalley","category-startups","tag-bionano","tag-electron-optica","tag-geniachip","tag-ibm-dna-transistor","tag-inserm","tag-ion-torrent","tag-life-technologies","tag-ligation","tag-nabsys","tag-nanopores","tag-nih","tag-noblegen","tag-oxford-nanopore","tag-pacific-bioscience","tag-reveo","tag-sequencage","tag-solid-technologies","tag-stratos-genomics","tag-terminateur-reversible","tag-zs-genetics"],"views":50201,"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/7233","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=7233"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/7233\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=7233"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=7233"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=7233"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}