{"id":7209,"date":"2012-08-10T11:15:59","date_gmt":"2012-08-10T09:15:59","guid":{"rendered":"http:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/?p=7209"},"modified":"2013-02-07T15:51:30","modified_gmt":"2013-02-07T13:51:30","slug":"technologies-sequencage-gnome-humain-3","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/2012\/technologies-sequencage-gnome-humain-3\/","title":{"rendered":"Les technologies de s\u00e9quen\u00e7age du g\u00e9nome humain – 3"},"content":{"rendered":"

Dans l\u2019\u00e9pisode pr\u00e9c\u00e9dent<\/a> de notre s\u00e9rie estivale, nous avons d\u00e9cortiqu\u00e9 le processus qui pr\u00e9c\u00e8de le s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN et toutes les \u00e9tapes de pr\u00e9paration. Avec la s\u00e9lection des cellules, leur pr\u00e9paration pour en extraire les longues mol\u00e9cules d\u2019ADN, leur pr\u00e9-d\u00e9coupage pour simplifier le processus du s\u00e9quen\u00e7age et leur multiplication avec la PCR pour augmenter la taille de l\u2019\u00e9chantillon disponible pour le s\u00e9quen\u00e7age. La plupart de ces \u00e9tapes pr\u00e9c\u00e8dent le s\u00e9quen\u00e7age mais nous verrons que certaines m\u00e9thodes permettent de simplifier le processus en \u00e9vitant notamment la PCR.<\/p>\n

Nous passons maintenant au c\u0153ur du sujet, le s\u00e9quen\u00e7age, sachant que nous allons \u00e0 la fois expliquer les basiques du s\u00e9quen\u00e7age avec les principales m\u00e9thodes utilis\u00e9es et aussi nous attarder sur les derni\u00e8res g\u00e9n\u00e9rations de s\u00e9quenceurs massivement parall\u00e8les.<\/p>\n

Les technologies de s\u00e9quen\u00e7age ont \u00e9t\u00e9 cr\u00e9\u00e9es au milieu des ann\u00e9es 1970 et ont \u00e9t\u00e9 continuellement am\u00e9lior\u00e9es depuis. Au d\u00e9part, le processus de s\u00e9quen\u00e7age, popularis\u00e9 par la m\u00e9thode de Sanger que nous allons d\u00e9crire \u00e9tait lent et g\u00e9n\u00e9rateur d\u2019erreurs. Les techniques et machines qui sont apparues depuis ont \u00e0 la fois automatis\u00e9 le processus, apport\u00e9 des variantes, parall\u00e9lis\u00e9 le s\u00e9quen\u00e7age et r\u00e9duit les erreurs. R\u00e9sultat, alors qu\u2019il a fallu plusieurs ann\u00e9es et des centaines de millions de dollars pour proc\u00e9der au premier s\u00e9quen\u00e7age g\u00e9n\u00e9rique du g\u00e9nome humain en 2000, on peut obtenir le m\u00eame r\u00e9sultat en moins d\u2019une journ\u00e9e et pour quelques milliers de dollars, l\u2019objectif \u00e9tant de descendre rapidement en dessous de $100 par g\u00e9nome.<\/p>\n

\"Cout<\/a><\/p>\n

Un concours a ainsi \u00e9t\u00e9 lanc\u00e9 qui rappelle les belles heures de l\u2019aviation, le Archon <\/strong>Genomics Xprize<\/a>. $10m r\u00e9compenseront l\u2019\u00e9quipe qui cr\u00e9era un appareil permettant de s\u00e9quencer 100 g\u00e9nomes humains de centenaires en moins de dix jours et pour moins de $1000 par personne. L\u2019id\u00e9e est de d\u00e9couvrir les g\u00e8nes qui prot\u00e8geraient de certaines maladies et assureraient la long\u00e9vit\u00e9 humaine. Ce prix est lanc\u00e9 par la XPrize Foundation<\/strong>, une association non lucrative am\u00e9ricaine qui a dans son board des personnalit\u00e9s aussi diverses que Larry Page (Google), Ray Kurzweil (entre autres, confondateur de la Singularity University<\/a>), Ariana Huffington, le r\u00e9alisateur James Cameron, le biologiste Craig Venter<\/a>, l\u2019astronaute d\u2019origine iranienne Anousheh Ansari, Ratan Tata (du groupe indien Tata) et Will Wright, le chief designer officer d\u2019Electronics Arts. Le prix est sponsoris\u00e9 par Express Scripts, une soci\u00e9t\u00e9 de services dans la sant\u00e9 aux USA. L\u2019une des soci\u00e9t\u00e9s \u00e0 participer \u00e0 ce concours est Ion Torrent <\/strong>dont nous d\u00e9crirons plus loin la machine, celle-l\u00e0 m\u00eame qui avait attir\u00e9 mon attention lors du CES 2012 !<\/p>\n

Mais avant d\u2019en venir l\u00e0, il faut remonter aux sources et notamment \u00e0 l\u2019une des premi\u00e8res m\u00e9thodes de s\u00e9quen\u00e7age\u2026<\/p>\n

M\u00e9thode de Sanger<\/strong><\/p>\n

La m\u00e9thode de s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN d\u00e9velopp\u00e9e par Frederick Sanger au milieu des ann\u00e9es 1970 a \u00e9t\u00e9 la plus r\u00e9pandue pendant pr\u00e8s d\u2019une vingtaine d\u2019ann\u00e9e. Elle concurren\u00e7ait au d\u00e9part celle de Maxam et Gibert cr\u00e9\u00e9e en 1976-1977. Cette derni\u00e8re s\u2019est rapidement \u00e9clips\u00e9e car elle s\u2019appuyait sur des produits toxiques et sur la meure de radioactivit\u00e9. Mais les principes \u00e9taient voisins d\u2019un point de vue conceptuel et on les retrouve jusqu\u2019\u00e0 aujourd\u2019hui dans certaines technologies de s\u00e9quen\u00e7age massivement parall\u00e8les.<\/p>\n

Sanger est l\u2019un des quatre scientifiques a avoir gagn\u00e9 deux prix Nobel dans l\u2019histoire. Ici, il s\u2019agissait du prix Nobel de chimie : l\u2019un en 1958 pour la d\u00e9couverte en 1951 de la s\u00e9quence d\u2019acides amin\u00e9s qui constitue la mol\u00e9cule d\u2019insuline (bovine) et l\u2019autre en 1980 pour le proc\u00e9d\u00e9 de s\u00e9quen\u00e7age qui porte son nom, invent\u00e9 en 1977.<\/p>\n

Amor\u00e7age<\/span><\/p>\n

Le s\u00e9quen\u00e7age s\u2019applique \u00e0 un brin d\u2019ADN de taille moyenne, de quelques centaines de bases, qui a \u00e9t\u00e9 obtenu par diff\u00e9rentes m\u00e9thodes. On utilise couramment la PCR que nous avons d\u00e9crite dans l\u2019article pr\u00e9c\u00e9dent<\/a> de cette s\u00e9rie, qui est la m\u00e9thode la plus r\u00e9cente et qui permet de d\u00e9multiplier plusieurs dizaines de millions de fois un petit \u00e9chantillon de brin d\u2019ADN, lui-m\u00eame g\u00e9n\u00e9r\u00e9 par une extraction d\u2019un ADN complet avec une enzyme de restriction. Mais on peut aussi utiliser d\u2019autres m\u00e9thodes comme le clonage de brins d\u2019ADN avec des vecteurs de clonage divers comme l\u2019ADN du bact\u00e9riophage M13.<\/p>\n

Comme pour la PCR, on commence par d\u00e9naturer par la chaleur (s\u00e9parer les deux brins) d\u2019un \u00e9chantillon d\u2019ADN en solution. L\u2019autre brin d\u2019ADN r\u00e9sultant de la d\u00e9naturation n\u2019est pas utilis\u00e9. Le brin d\u2019ADN doit \u00eatre en quantit\u00e9 suffisante, \u00e0 savoir que l\u2019on en dispose de plusieurs dizaines de millions. La quantit\u00e9 est rendue n\u00e9cessaire par le moyen de d\u00e9tection des s\u00e9quences de base utilis\u00e9 dans la m\u00e9thode. On ajoute au brin une amorce de 18 bases et quelques qui ne fonctionne que dans un sens (dit \u201cmontant\u201d) en s\u2019accrochant au bout des brins d\u2019ADN \u00e0 r\u00e9pliquer et qui servira de point de d\u00e9part pour la copie du reste du brin. L\u2019amorce est le \u201cn\u00e9gatif\u201d au niveau des bases du d\u00e9but du brin d\u2019ADN \u00e0 r\u00e9pliquer. Dans la PCR, on utilise des amorces \u201cmontantes\u201d et \u201cdescendantes\u201d pour r\u00e9pliquer les deux brins d\u2019ADN d\u00e9natur\u00e9.<\/p>\n

\"Methode<\/a><\/p>\n

Polym\u00e9risation<\/span><\/p>\n

C\u2019est la r\u00e9action chimique la plus importante du processus : elle permet le clonage partiel du brin d\u2019ADN \u00e0 qui on a ajout\u00e9 son amorce.<\/p>\n

La polym\u00e9risation s\u2019appuie sur l\u2019emploi d\u2019une ADN polym\u00e9rase qui assemble des nucl\u00e9otides au brin \u00e0 compl\u00e9ter. Ces nucl\u00e9otides sont des mol\u00e9cules dNTP ou d\u00e9soxyribonucl\u00e9otides qui associent une des quatre bases de l\u2019ADN (d\u2019o\u00f9 les appellations dATP, dTTP, dCTP et dGTP), un sucre (pentose) et un triphosphate. Ces dNTP s\u2019associent aux nucl\u00e9otides compl\u00e9mentaires du brin d\u2019ADN \u00e0 s\u00e9quencer sous l\u2019effet de l\u2019ADN polym\u00e9rase. On appelle cette phase du processus la SBS, \u201cSequencing by Synthesis\u201d. Elle utilis\u00e9e dans tout un tas de m\u00e9thodes diff\u00e9rentes de s\u00e9quen\u00e7age.<\/p>\n

\"Methode<\/a><\/p>\n

Fin de polym\u00e9risation<\/span><\/p>\n

La m\u00e9thode consiste \u00e0 arr\u00eater cette r\u00e9action de polym\u00e9risation \u00e0 chaque position de nucl\u00e9otide dans le brin. On utilise pour cela des mol\u00e9cules ddNTP ou did\u00e9soxyribonucl\u00e9otides (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP). Ces nucl\u00e9otides bloquent la polym\u00e9risation de l\u2019ADN du fait d\u2019une liaison OH qui est remplac\u00e9e par une liaison H par rapport aux nucl\u00e9otides \u00e9quivalentes. La liaison OH s\u2019associe au premier P (phosphore) du dNTP suivant lors de la polym\u00e9risation. Dans le O, pas de polym\u00e9risation. On met beaucoup moins de ddNTP que de dNTP pour que la polym\u00e9risation se poursuivre tant que faire ce peut. On contr\u00f4le aussi sa vitesse avec la temp\u00e9rature.<\/p>\n

\"Methode<\/a><\/p>\n

Les ddNTP sont marqu\u00e9s par \u201cfluorescence\u201d pour que l\u2019on puisse les d\u00e9tecter plus loin dans le processus. Le label fluorescent est du S-35 thiophosphate, ou 35S-dATP, qui s\u2019associe aux ddNTP du c\u00f4t\u00e9 des phosphates sans emp\u00eacher la liaison OH-P d\u2019op\u00e9rer avec le dNTP pr\u00e9c\u00e9dant dans le processus de polym\u00e9risation. La proportion ddNTP sur dNTP est g\u00e9n\u00e9ralement de 1%.<\/p>\n

Dans ce processus, la polym\u00e9risation dure une quinzaine de minutes.<\/p>\n

D\u00e9naturation<\/span><\/p>\n

Une fois encore, on va proc\u00e9der par chauffage pour s\u00e9parer les brins d\u2019ADN r\u00e9pliqu\u00e9s et les r\u00e9plicats partiels obtenus par polym\u00e9risation que l\u2019on souhaite conserver. Il reste dans la solution une soupe avec : nos brins d\u2019ADN n\u00e9gatifs non r\u00e9pliqu\u00e9s, les brins entiers r\u00e9pliqu\u00e9s, le relicat de dNTP et de ddNTP ainsi que l\u2019ADN polym\u00e9rase sans compter les reliquats de phosphores issus de la polym\u00e9risation (les dNTP lib\u00e8rent un pyrophosphate lors de la polym\u00e9risation, cf le sch\u00e9ma pr\u00e9c\u00e9dent, ce pyrophosphate ne sert \u00e0 rien ici, mais on l\u2019utilise dans le pyros\u00e9quen\u00e7age dont nous parlerons plus loin).<\/p>\n

On se retrouve avec une soupe dont des brins d\u2019ADN synth\u00e9tis\u00e9s avec une extr\u00e9mit\u00e9 fluorescente qu\u2019il va falloir trier par taille pour reconstituer leur s\u00e9quence de bases (A, T, C, G). Mais auparavant, on aura \u00e9limin\u00e9 par traitement chimiques divers les r\u00e9sidus cit\u00e9s ci-dessus.<\/p>\n

\"Methode<\/a><\/p>\n

Tri sur gel<\/span><\/p>\n

Dans la m\u00e9thode de Sanger, on proc\u00e8de g\u00e9n\u00e9ralement au tri avec une \u00e9lectrophor\u00e8se sur une solution contenant 1% de gel d\u2019agarose (extrait de l\u2019agar-agar, d\u00e9j\u00e0 \u00e9voqu\u00e9 dans cet article<\/a>\u2026). Il se trouve que les mol\u00e9cules d\u2019ADN sont charg\u00e9es n\u00e9gativement et en fonction de leur longueur. On applique une tension \u00e9lectrique continue dans une solution contenant ce gel d\u2019agarose et \u00e0 plat sur un filtre en nylon. La tension va faire migrer les mol\u00e9cules d\u2019ADN vers le + au niveau des phosphates et en fonction de leur taille, le tout\u00a0 \u00e0 50\u00b0C. Les petites vont aller le plus loin. Le gel d\u2019agarose est une sorte d\u2019amortisseur ou de r\u00e9gulateur de ce processus de migration.<\/p>\n

Les mol\u00e9cules les plus courtes correspondront aux bases qui \u00e9taient proches de l\u2019amorce (primer) du processus. Le gel d\u2019agarose est associ\u00e9 \u00e0 diff\u00e9rentes autres mol\u00e9cules dont de l\u2019ur\u00e9e qui \u00e9vite que les mol\u00e9cules d\u2019ADN se replient sur elles-m\u00eames. Une fois la migration termin\u00e9e, on va fixer l\u2019ensemble par ultraviolet.<\/p>\n

Les mol\u00e9cules fluorescentes de ddNTP ne sont pas visibles \u00e0 l\u2019\u0153il nu. On va les r\u00e9v\u00e9ler \u00e0 l\u2019aide d\u2019un laser qui va les exciter et les faire \u00e9mettre de la lumi\u00e8re dans une couleur diff\u00e9rente. Une cam\u00e9ra enregistre alors l\u2019ensemble du gel.<\/p>\n

Un gel fait quelques dizaines de centim\u00e8tres de longueur et permet d\u2019identifier quelques centaines de bases. C\u2019est li\u00e9 \u00e0 la r\u00e9solution du papier ! D\u2019o\u00f9 le fait que la m\u00e9thode de Sanger est assez lente. Cette phase d\u2019\u00e9lectrophor\u00e8se sur gel dure plusieurs heures ! Elle a bien \u00e9t\u00e9 utilis\u00e9e pour s\u00e9quencer diff\u00e9rents bact\u00e9ries et cellules ainsi que l\u2019ADN humain dans le Human Genome Project, mais a alors n\u00e9cessit\u00e9 beaucoup de temps et de machines. Il a aussi fallu automatiser au maximum toutes les \u00e9tapes de ce processus.<\/p>\n

\"Methode<\/a><\/p>\n

Dans les ann\u00e9es 1980\/90, on utilisait quatre pr\u00e9parations, une avec chaque type de ddNTP car si on savait les marquer par radioactivit\u00e9 ou par fluorescence, on ne savait pas les distinguer. Le tri des brins d\u2019ADN synth\u00e9tis\u00e9s se faisait donc en quatre parties, une par base. Depuis, on utilise des marqueurs fluorescents distincts pour chacun des quatre ddNTP et ils sont activ\u00e9s par laser. Ce qui permet de ne faire la polym\u00e9risation que dans un seul \u00ab bain \u00bb avec l\u2019ensemble des ddNTP m\u00e9lang\u00e9s. La lecture sur gel se fait sur une seule colonne \u201cen couleur\u201d et en g\u00e9n\u00e9ral avec une cam\u00e9ra motoris\u00e9e qui se d\u00e9place le long du gel.<\/p>\n

\"Lecture<\/a><\/p>\n

Dans la pratique, on obtient en fait une courbe qui associe le continuum de luminosit\u00e9 sur les quatre couleurs analys\u00e9es dans la fluorescence. On en d\u00e9duit la succession de bases. Mais le processus est entach\u00e9 d\u2019erreurs et on les \u00e9limine en faisant plusieurs mesures redondantes et avec une analyse statistique (la base la plus fr\u00e9quente gagne en cas de doute).<\/p>\n

\"DNA<\/a><\/p>\n

Dans les s\u00e9quenceurs automatiques de seconde g\u00e9n\u00e9ration, on a remplac\u00e9 l\u2019\u00e9lectrophor\u00e8se sur gel par une \u00e9lectrophor\u00e8se capillaire dans un tube extr\u00eamement fin. Le r\u00e9sultat est bien plus rapide et permet de lire jusqu\u2019\u00e0 un millier de s\u00e9quences de bases. Ce proc\u00e9d\u00e9 appel\u00e9 HPLC (high-performance liquid chromatography, ou high-pressure lc) utilise en lieu et place du filtre plat de gel d\u2019agarose un tube tr\u00e8s fin de 4 mm de diam\u00e8tre qui met sous pression le liquide \u00e0 analyser.<\/p>\n

\"HPLC<\/a><\/p>\n

Le liquide sort \u00e0 l\u2019autre extr\u00e9mit\u00e9 du tube et est analys\u00e9 par un chromatographe utilisant des LED. le proc\u00e9d\u00e9 est am\u00e9lior\u00e9 avec la UHPLC (Ultra-High Performance Liquid Chromatography). Voici quelques exemples de syst\u00e8mes de HPLC et UHPLC, sachant que leur usage d\u00e9passe de loin le s\u00e9quen\u00e7age d\u2019ADN. La spectrographie en phase liquide a plein d\u2019applications dans la sant\u00e9 et la chimie. On peut l\u2019utiliser pour identifier les composants chimiques d\u2019un aliment industriel, mesurer divers niveaux de toxicit\u00e9, etc.<\/p>\n

\"HPLC<\/a><\/p>\n

Voil\u00e0 pour la m\u00e9thode de Sanger et ses \u00e9volutions.<\/p>\n

Passons maintenant aux autres m\u00e9thodes et technologies de s\u00e9quen\u00e7age apparues ces dix derni\u00e8res ann\u00e9es, dans un rythme d\u2019innovation qui s\u2019est sans cesse acc\u00e9l\u00e9r\u00e9 au point d\u2019aller plus vite que la fameuse loi de Moore en termes de capacit\u00e9 de traitement.<\/p>\n

O\u00f9 sont les variantes ? De plusieurs ordres :<\/p>\n