{"id":7198,"date":"2012-08-02T18:32:18","date_gmt":"2012-08-02T16:32:18","guid":{"rendered":"http:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/?p=7198"},"modified":"2013-02-07T15:50:24","modified_gmt":"2013-02-07T13:50:24","slug":"technologies-sequencage-genome-humain-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.oezratty.net\/wordpress\/2012\/technologies-sequencage-genome-humain-2\/","title":{"rendered":"Les technologies de s\u00e9quen\u00e7age du g\u00e9nome humain – 2"},"content":{"rendered":"

Dans l\u2019\u00e9pisode pr\u00e9c\u00e9dent<\/a> de cette s\u00e9rie estivale sur le s\u00e9quen\u00e7age du g\u00e9nome humain, nous avons fait le point sur la mani\u00e8re dont l\u2019ADN \u00e9tait construite en la d\u00e9cortiquant comme une poup\u00e9e russe. Nous avons notamment d\u00e9crit ses \u201cbases\u201d, les primitives de la mol\u00e9cule, puis les s\u00e9quences codantes et non codantes qui conditionnent les g\u00e8nes et leur expression dans les cellules.<\/p>\n

Dans cette seconde partie, nous allons \u00e9tudier les techniques et appareillages mis en \u0153uvre pour s\u00e9quencer l\u2019ADN en nous focalisant sur le cas de l\u2019ADN du g\u00e9nome humain.<\/p>\n

Il existe plusieurs m\u00e9thodes de s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN, la plus courante au d\u00e9part \u00e9tant celle de Sanger. Le s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN est un processus chimique complexe qui comprend de nombreuses \u00e9tapes. Cela explique pourquoi et Sanger et Gilbert qui est avec Maxam cr\u00e9ateur d\u2019une autre m\u00e9thode de s\u00e9quen\u00e7age maintenant abandonn\u00e9e ont tous les deux obtenu le prix Nobel de chimie et pas de m\u00e9decine !<\/p>\n

Le s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN s\u2019appuie sur des \u00e9tapes communes aux diff\u00e9rentes m\u00e9thodes employ\u00e9es que je r\u00e9sume et vulgarise comme suit sachant que le s\u00e9quen\u00e7age proprement dit commence \u00e0 la cinqui\u00e8me \u00e9tape de ce processus :<\/p>\n

1) La s\u00e9lection<\/strong> des cellules destin\u00e9es au s\u00e9quen\u00e7age, en g\u00e9n\u00e9ral, les lymphocytes du sang pour ce qui est des recherches cliniques et biologiques classiques.<\/p>\n

2) L\u2019extraction <\/strong>de l\u2019ADN des cellules et leur purification, qui passe par le broyage des cellules et l\u2019\u00e9limination de ce qui ne nous int\u00e9resse pas, \u00e0 savoir principalement les lipides et prot\u00e9ines.<\/p>\n

3) Le d\u00e9coupage <\/strong>des brins d\u2019ADN \u00e0 diff\u00e9rents endroits connus \u00e0 l\u2019avance qui permettent de s\u00e9lectionner les portions \u00e0 \u00e9tudier et qui s\u2019appuie sur des enzymes de restriction.<\/p>\n

4) La multiplication <\/strong>de ces brins pour augmenter leur nombre par millions et faciliter la lecture des r\u00e9sultats dans les phases suivantes. Celle-ci s\u2019appuie le plus souvent sur de la PCR.<\/p>\n

5) Le s\u00e9quen\u00e7age <\/strong>proprement dit s\u2019appuie sur une r\u00e9plication des brins d\u2019ADN s\u2019arr\u00eatant de mani\u00e8re al\u00e9atoire sur chacune des bases de l\u2019ADN. Elle g\u00e9n\u00e8re une soupe avec des brins de diff\u00e9rente taille dont les extr\u00e9mit\u00e9s sont marqu\u00e9es, souvent par fluorescence, afin que l\u2019on puisse identifier les quatre bases de l\u2019ADN qui sont \u00e0 leur extr\u00e9mit\u00e9. On trie alors par taille ou longueur les brins rogn\u00e9s et marqu\u00e9s, ce se faisait au d\u00e9part sur des gels mais exploite maintenant diff\u00e9rentes techniques \u00e0 base de nanotechnologies dans les s\u00e9quenceurs de derni\u00e8re g\u00e9n\u00e9ration.<\/p>\n

6) La lecture <\/strong>des r\u00e9sultats, historiquement faite sur un gel sur quatre colonnes avec des traits indiquant la pr\u00e9sence des quatre bases.<\/p>\n

7) Leur exploitation <\/strong>pour recoller les morceaux et reconstituer le fragment d\u2019ADN ou l\u2019ADN complet que l\u2019on souhaite s\u00e9quencer, sachant que le processus est g\u00e9n\u00e9ralement redondant pour d\u00e9tecter et supprimer les erreurs de s\u00e9quen\u00e7age.<\/p>\n

\"Cycle<\/a><\/p>\n

La variantes de processus de s\u00e9quen\u00e7age concernent en particulier le moment o\u00f9 l\u2019on fait une PCR pour d\u00e9multiplier les brins et sur la parall\u00e9lisation du traitement de chaque brin issu du premier d\u00e9coupage de l\u2019ADN.<\/p>\n

Nous allons examiner ce processus \u00e9tape par \u00e9tape sachant que c’est dans la cinqui\u00e8me partie que nous d\u00e9partagerons les grandes m\u00e9thodes de s\u00e9quen\u00e7age et notamment celles qui font appel \u00e0 du s\u00e9quen\u00e7age massivement parall\u00e8le. Le tout dans le troisi\u00e8me article de cette s\u00e9rie d’\u00e9t\u00e9.<\/p>\n

Etape 1 : s\u00e9lection des cellules<\/strong><\/p>\n

Le poids de l\u2019ADN repr\u00e9sente environ 1% de celui des cellules. Un corps humain adulte comprend donc environ 600g d\u2019ADN\u2026 ce qui n\u2019est pas rien ! En principe, on peut s\u00e9quencer l\u2019ADN \u00e0 partir de n\u2019importe quelle cellule, y compris une cellule d\u2019un organisme cliniquement mort, voire m\u00eame fossilis\u00e9. L\u2019ADN le plus ancien qui ait \u00e9t\u00e9 r\u00e9cup\u00e9r\u00e9 \u00e9tait celui d\u2019un col\u00e9opt\u00e8re du cr\u00e9tac\u00e9 vieux de plus de 120 millions d\u2019ann\u00e9es (source<\/a>) ! Tout d\u00e9pend du mat\u00e9riau vivant dont on dispose et aussi de l\u2019usage qui est fait du s\u00e9quen\u00e7age : identification d\u2019un g\u00e8ne, s\u00e9quen\u00e7age complet de l\u2019ADN, test de paternit\u00e9, reconnaissance d\u2019individus dans le cadre de la police scientifique, etc. Dans ce dernier cas, tout est bon \u00e0 prendre : cheveux, salive ou sperme. Mais le processus d\u2019extraction de l\u2019ADN est facilit\u00e9 par l\u2019usage de cellules issues de liquides biologiques, et en particulier du sang.<\/p>\n

Pour le s\u00e9quen\u00e7age d\u2019ADN complet, on passe g\u00e9n\u00e9ralement par le sang qui est pr\u00e9lev\u00e9 de mani\u00e8re classique dans le pli du coude comme dans toute prise de sang. Les cellules sanguines pr\u00e9sentent la particularit\u00e9 de ne pas se diviser\u00a0 – elles sont g\u00e9n\u00e9r\u00e9es dans les os – et donc d\u2019avoir un ADN qui ne se pr\u00e9sente pas sous forme de chromosomes diplo\u00efdes (avec l\u2019ADN r\u00e9pliqu\u00e9 autour du centrom\u00e8re) mais de simple brin autour d\u2019un centrom\u00e8re. Le sang pr\u00e9lev\u00e9 subit un traitement chimique et de de centrifugation pour en extraire les lymphocytes, un des types de globules blancs (voir ici<\/a>). Ceux-ci ne repr\u00e9sentent que 1% de la composition du sang. On a donc les cellules. Etape suivante : r\u00e9cup\u00e9rer l\u2019ADN qu\u2019elles contiennent.<\/p>\n

Etape 2 : extraction de l\u2019ADN des cellules<\/strong><\/p>\n

L\u2019ADN est confin\u00e9 dans le nucl\u00e9ole au sein du noyau des cellules. Comment fait-on pour se d\u00e9barrasser non seulement de tout ce qu\u2019il y a autour du nucl\u00e9ole dans les cellules mais de tous les autres composantes, notamment prot\u00e9iniques, des cellules ?<\/p>\n

En pratique, chacun peut tenter l\u2019exp\u00e9rience avec les moyens du bord et des oignons ou des bananes (cf ici<\/a>). On d\u00e9truit la paroi cellulaire (lyse) par traitement m\u00e9canique (\u00e9crasement dans un mortier) en pr\u00e9sence de sel. Un solvant organique comme du liquide vaisselle est utilis\u00e9 pour \u00e9liminer les lipides, prot\u00e9ines et autres acides des cellules. On filtre alors le r\u00e9sultat et on r\u00e9cup\u00e8re l\u2019ADN par pr\u00e9cipitation dans l\u2019alcool. L\u2019ADN peut \u00eatre color\u00e9 pour \u00eatre rendu visible \u00e0 l\u2019\u0153il nu sous forme de pelotes de filaments.<\/p>\n

En laboratoire, c\u2019est un peu plus compliqu\u00e9 car l\u2019objectif est d\u2019obtenir un ADN purifi\u00e9 vraiment d\u00e9barrass\u00e9 de tout le reste des cellules. Apr\u00e8s broyage des cellules, on dissout le r\u00e9sultat avec une solution de lyse comme le Buffer P2<\/strong> de Qiagen (37\u20ac le demi-litre). Certaines solutions de lyse vont jusqu\u2019\u00e0 2500\u20ac le litre (le Trizol LS Reagent<\/a>). Cette solution va dissoudre les lipides et d\u00e9naturer les prot\u00e9ines (d\u00e9plier leur structure mol\u00e9culaire tridimensionnelle). Cela va notamment dissoudre les prot\u00e9ines de la chromatine comme les histones autour desquelles l\u2019ADN est enroul\u00e9.<\/p>\n

Il existe des machines sp\u00e9cialis\u00e9es dans la pr\u00e9paration des cellules comme la Qiagen TissueLyser II<\/strong> (ci-dessous<\/em>) qui optimise en broyage des cellules en associant la centrifugation et l\u2019usage de microbilles de 0,1 microns. Au passage, cela permet de vendre du consommable, le business model de base de tous les fabricants de ces instruments de laboratoire, m\u00eame si ces derniers restent assez chers (5700\u20ac pour le Qiagen).<\/p>\n

\"Qiogen<\/a><\/h6>\n

On \u00e9limine ensuite les prot\u00e9ines avec diff\u00e9rents solvants comme le dod\u00e9cylsulfate de sodium (SDS<\/a>, utilis\u00e9 dans les d\u00e9tergents domestiques ou le dentifrice) et avec de la prot\u00e9inase K, une enzyme qui les dig\u00e8re. Dans l\u2019\u00e9prouvette, l\u2019ADN est r\u00e9cup\u00e9r\u00e9 par d\u00e9cantation ou centrifugation (cf centrifugeuse eppendorf ci-dessous<\/em>). Enfin, on la pr\u00e9cipite avec de l\u2019\u00e9thanol et on la nettoie ensuite avec du ph\u00e9nol et du chloroforme pour la d\u00e9barrasser de tous les solvants utilis\u00e9s.<\/p>\n

\"Eppendorf-5804R_Multipurpose-Centrifuge-open\"<\/a><\/p>\n

Tout ce processus peut durer plusieurs heures lorsqu\u2019il est r\u00e9alis\u00e9 \u201c\u00e0 la mano\u201d. Et on n\u2019a pas encore d\u00e9marr\u00e9 le s\u00e9quen\u00e7age proprement dit ! En fait, le processus d\u2019extraction d\u2019ADN a lui aussi b\u00e9n\u00e9fici\u00e9 de progr\u00e8s technologiques ces derni\u00e8res ann\u00e9es. Il en va ainsi du syst\u00e8me QuickGene 810 <\/strong>(ci-dessous<\/em>) cr\u00e9\u00e9 par Fujifilm Life Science et distribu\u00e9 par Kurabo qui permet de g\u00e9rer tout ce processus en 6 minutes pour extraire l\u2019ADN du sang. Au lieu de la centrifugation, il utilise un syst\u00e8me de filtration sous pression \u00e0 base de nano-membranes.<\/p>\n

\"QuickGene<\/a><\/h5>\n

Il existe m\u00eame des solutions encore plus simples \u00e0 base de seringues d\u2019extraction d\u2019ADN comme le Pinpoint Slide DNA Isolation System <\/strong>de Zymo Research. Mais la digestion des prot\u00e9ines \u00e0 base de Prot\u00e9inase K dure tout de m\u00eame 4 heures. Dans la m\u00eame veine, il y a aussi le LeukoLOCK <\/strong>de la soci\u00e9t\u00e9 Ambion qui est sp\u00e9cialis\u00e9 sur l\u2019extraction d\u2019ADN de cellules sanguines. Ainsi que le MELT<\/strong> \u00e9galement de Ambion, utilisable pour les autres types de cellules et qui utilise une combinaison propri\u00e9taire d\u2019enzymes. Enfin, citons le kit Agencourt Genfind v2 <\/strong>de Beckman Coulter qui fonctionne avec du sang\u00a0 et du s\u00e9rum et utilise une technologie \u00e0 base de magn\u00e9tisme, la technique de \u201cSolid Phase Reversible Immobilization\u201d, qui permet une extraction en moins de 3 heures avec un haut rendement. Cette forme d\u2019extraction est utilis\u00e9e \u00e0 la fois au d\u00e9but du processus, au niveau de l\u2019extraction, et ensuite, apr\u00e8s PCR.<\/p>\n

On n\u2019en a pas encore termin\u00e9 car il faut maintenant purifier l\u2019ADN ainsi obtenu. On peut aussi le faire par pr\u00e9cipitations successives dans l\u2019\u00e9thanol ou par chromatographie. En ajoutant du sel (NaCl), on fait apparaitre l\u2019ADN sous la forme d\u2019un \u201cnuage de m\u00e9duse\u201d qui est une pelote de longs filaments d\u2019ADN d\u00e9pli\u00e9s. Et cela ressemble \u00e0 \u00e7a quand on en a une grande quantit\u00e9 (photo prise au G\u00e9n\u00e9thon \u00e0 Evry) :<\/p>\n

\"ADN<\/a><\/p>\n

D\u2019un point de vue pratique, l\u2019ADN extrait peut-\u00eatre conserv\u00e9 \u00e0 sec apr\u00e8s s\u00e9chage sous vide ou \u00eatre dissous dans de l\u2019eau pure ou dans un m\u00e9lange trishydroxym\u00e9thylaminom\u00e9thane et acide \u00e9thyl\u00e8ne diamine t\u00e9tra-ac\u00e9tique, commun\u00e9ment appel\u00e9 Tris-EDTA.<\/p>\n

Etape 3 : d\u00e9coupage<\/strong><\/p>\n

Apr\u00e8s l\u2019\u00e9tape 2, nous avons obtenu des microgrammes d\u2019ADN purifi\u00e9. Alors, on le s\u00e9quence directement ? Bien non. On va en g\u00e9n\u00e9ral d\u2019abord le d\u00e9couper en morceaux, puis \u201camplifier\u201d ces morceaux en les r\u00e9pliquant. Tout du moins pour la plupart des m\u00e9thodes de s\u00e9quen\u00e7age de premi\u00e8re et de seconde g\u00e9n\u00e9ration.<\/p>\n

Le d\u00e9coupage s\u2019effectue \u00e0 l\u2019aide de prot\u00e9ines sp\u00e9cialis\u00e9es, les enzymes de restriction, qui vont litt\u00e9ralement couper l\u2019ADN en deux. Elles op\u00e8rent au niveau des liaisons phosphodiester qui relient les nucl\u00e9otides entre elles (entre phosphate et sucre). Ces ciseaux chimiques coupent l\u2019ADN \u00e0 des endroits bien pr\u00e9cis appel\u00e9s \u201csites de restriction\u201d identifi\u00e9s par de courtes s\u00e9ries de 4 \u00e0 10 paires de bases. Dans le milieu naturel, ces enzymes de restriction sont utilis\u00e9es par les bact\u00e9ries pour se prot\u00e9ger des virus bact\u00e9riophages qui les attaquent. En gros, elles taillent en pi\u00e8ces l\u2019ADN de ces virus.<\/p>\n

\"Enzyme<\/a><\/p>\n

La coupure op\u00e9r\u00e9e par les enzymes de restriction touche les deux brins de l\u2019ADN. Elle a lieu entre liaisons du m\u00eame type (A-G et G-A par exemple) au milieu ou pas de la s\u00e9quence de paires de bases et sur des s\u00e9quences palindromiques, \u00e0 savoir des s\u00e9quences ou les deux brins sont sym\u00e9triques l\u2019un de l\u2019autre comme illustr\u00e9 ci-dessous. L\u2019exemple ci-dessous \u00e0 gauche pr\u00e9sente le ciseau de l\u2019enzyme EcoRI qui provient de la bact\u00e9rie Escherichia Coli. Celui de droite correspond \u00e0 l\u2019enzyme Sma<\/em>I issue de la bact\u00e9rie pathog\u00e8ne Serratia marcescens, une habitu\u00e9e des infections nosocomiales.<\/em><\/p>\n

\"Exemples<\/a><\/p>\n

La contrapos\u00e9e des enzymes de restrictions (endonucl\u00e9ases) sont les ADN ligases qui peuvent raccommoder des brins d\u2019ADN cass\u00e9s. Elles op\u00e8rent lors du processus de r\u00e9plication naturel de l\u2019ADN ou bien dans les techniques de g\u00e9nie g\u00e9n\u00e9tique.<\/p>\n

Les enzymes de restriction ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9couvertes \u00e0 la fin des ann\u00e9es 1970 par HindII et leur inventaire r\u00e9alis\u00e9 dans les ann\u00e9es 1970 par Aber, Nathans et Smith (tous prix Nobel). Parmi les applications de ces d\u00e9couvertes, on compte la fabrication d\u2019insuline humaine synth\u00e9tique \u00e0 partir de bact\u00e9ries Escherichia Coli, en lieu et place de l\u2019insuline \u00e0 base de pancr\u00e9as de porc qui ne pouvait pas \u00eatre produite en volume et qui n\u2019\u00e9tait pas parfaitement biocompatible avec le corps humain.<\/p>\n

A ce jour, on a identifi\u00e9 environ 3000 enzymes de restriction s\u2019appliquant \u00e0 l\u2019homme et 600 d\u2019entre elles sont couramment exploit\u00e9es dans la pr\u00e9paration de l\u2019ADN pour son s\u00e9quen\u00e7age. Mais elles ont plein d\u2019autres utilit\u00e9s dans l\u2019industrie, la chimie – comme avec les enzymes gloutons des lessives \u2013, l\u2019agriculture et la sant\u00e9.<\/p>\n

On distingue trois types d’enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III reconnaissent des sites de restriction mais coupent l\u2019ADN en un endroit al\u00e9atoire pouvant \u00eatre \u00e0 25 jusqu\u2019\u00e0 1000 paires de base du rep\u00e8re (type I et III). les enzymes type II coupent l\u2019ADN \u00e0 l\u2019endroit de la s\u00e9quence reconnue.<\/p>\n

Pour le s\u00e9quen\u00e7age de l\u2019ADN, on essaye de couper celle-ci pour cr\u00e9er des morceaux faisant moins que 1 mbases (1 million de paires de bases). Comme il y a environ 3 millions de bases dans l\u2019ADN haplo\u00efde (hors phase de duplication) et plus de 23000 g\u00e8nes identifi\u00e9s, cela veut dire que les enzymes de restriction couvrent une partie seulement du g\u00e9nome et qu\u2019elles permettent de s\u00e9quencer des morceaux d\u2019ADN qui comprennent parfois plusieurs g\u00e8nes.<\/p>\n

D\u2019un point de vue pratique, le d\u00e9coupage de l\u2019ADN pour son s\u00e9quen\u00e7age va s\u2019appuyer sur l\u2019emploi de cartes de restrictions qui font l\u2019inventaire des sites de restriction connus dans l\u2019ADN humain. On trouve d\u2019une part des bases de donn\u00e9es de \u201cciseaux\u201d qui permettent de d\u00e9couper un fragment d\u2019ADN identifi\u00e9 \u00e0 un endroit donn\u00e9 comme la NEBCutter V2<\/a> ou le WebCutter<\/a> qui partagent comme de nombreux sites web de g\u00e9n\u00e9tique un look tr\u00e8s ann\u00e9es 1990. Une fois qu\u2019on a choisi ses ciseaux, il faut trouver les enzymes associ\u00e9es. On peut aller taper dans une base d\u2019enzymes de restriction comme Rebase<\/a>. Et apr\u00e8s ? On ach\u00e8te les enzymes chez le marchand d\u2019enzymes ! Il y en a des dizaines dans le monde et ils sont notamment r\u00e9pertori\u00e9s ici<\/a>. Par exemple, chez New England Biolabs, on pourra trouver la Sacl qui coupe la s\u00e9quence sym\u00e9trique GAGCTC comme indiqu\u00e9 ci-dessous. On trouve aussi des grossistes et revendeur comme le fran\u00e7ais Ozyme<\/a>. Chaque pack d\u2019enzyme coute environ 50\u20ac.<\/p>\n

\"Exemple<\/a><\/p>\n

On fait agir les enzymes avec l\u2019ADN dans de l\u2019eau purifi\u00e9e compl\u00e9t\u00e9e d\u2019une solution tampon (buffer) et dans des petits tubes plac\u00e9s dans un bain marie ou un four \u00e0 la temp\u00e9rature de 37\u00b0\u2026 celle du corps humain (exemple ci-dessous \u00e0 droite<\/em>) ! On a alors comme r\u00e9sultat \u201cun\u201d morceau d\u2019ADN qui va passer \u00e0 l\u2019\u00e9tape suivante de l\u2019amplification, le plus souvent par PCR.<\/p>\n

Dans certaines m\u00e9thodes de s\u00e9quen\u00e7age massivement parall\u00e8le, on d\u00e9coupe al\u00e9atoirement l\u2019ADN en morceaux de taille variable pour cr\u00e9er une \u201cbiblioth\u00e8que de brins d\u2019ADN\u201d (DNA template library) qui seront ensuite s\u00e9quenc\u00e9s simultan\u00e9ment. Nous verrons cela plus loin dans notre investigation du sujet.<\/p>\n

\"IEN2023A<\/a>\"Four<\/a><\/p>\n

Les enzymes sont conserv\u00e9es r\u00e9frig\u00e9r\u00e9es \u00e0 des temp\u00e9ratures comprises aux alentours de -20\u00b0C dans des frigos de labo qui pr\u00e9sentent plusieurs particularit\u00e9s : ils sont r\u00e9gul\u00e9s par microprocesseurs, dot\u00e9s d\u2019alarmes sonores lorsque la temp\u00e9rature n\u2019est pas la bonne, leur compresseur est en haut du frigo pour faciliter la circulation de l\u2019air et ils n\u2019ont pas de syst\u00e8me automatique de d\u00e9givrage (qui fait remonter la temp\u00e9rature \u00e0 0\u00b0C toutes les 24h dans les cong\u00e9lateurs domestiques). Exemple \u00e0 gauche ci-dessus.<\/em><\/p>\n

Etape 4 : amplification<\/strong><\/p>\n

Derni\u00e8re \u00e9tape que nous allons aborder dans cet article, l\u2019amplification. Elle consiste \u00e0 prendre un brin d\u2019ADN qui a \u00e9t\u00e9 obtenu par d\u00e9coupe via enzyme de restriction et \u00e0 le d\u00e9multiplier jusqu\u2019\u00e0 des millions de fois pour en permettre le s\u00e9quen\u00e7age. Il existe plusieurs m\u00e9thodes de multiplication mais je vais me focaliser ici sur la plus connue et la plus utilis\u00e9e : la polymerase chain reaction (PCR) sachant qu\u2019il en existe plein de variantes.<\/p>\n

La PCR est un proc\u00e9d\u00e9 invent\u00e9 au milieu des ann\u00e9es 1980 et qui a r\u00e9volutionn\u00e9 le g\u00e9nie g\u00e9n\u00e9tique. Avec la d\u00e9couverte des ADN polym\u00e9rases qui interviennent dans la r\u00e9plication de l\u2019ADN et des enzymes de restriction, c\u2019est l\u2019un des maillons cl\u00e9s qui a permis le d\u00e9codage du g\u00e9nome humain en 2000.<\/p>\n

La PCR est une sorte de photocopieuse d\u2019ADN qui permet de reproduire rapidement le processus de r\u00e9plication semi-conservative de l\u2019ADN qui intervient dans celui de la division cellulaire. Il permet de multiplier les brins d\u2019ADN par 2, puis 4, puis 8, etc en peu de temps et de g\u00e9n\u00e9rer un \u00e9chantillon de plusieurs dizaines de millions de brins d\u2019ADN identiques que l\u2019on pourra ensuite exploiter dans le s\u00e9quen\u00e7age. Cette amplification est rendue n\u00e9cessaire du fait des techniques de lecture optique du r\u00e9sultat du s\u00e9quen\u00e7age que nous verrons plus loin. La PCR s\u2019est aussi r\u00e9v\u00e9l\u00e9e tr\u00e8s utile pour \u00e9lucider des crimes lorsque l\u2019on ne dispose que d\u2019un tout petit nombre de cellules, comme un bout de cheveux.<\/p>\n

La PCR fonctionne sur un cycle r\u00e9p\u00e9t\u00e9 n fois qui comporte trois \u00e9tapes :<\/p>\n